שיטות לטיהור חלבונים בביוטכנולוגיה

מרכיב חשוב במחקר הביוטכנולוגיה הוא השימוש בטכניקות הנדסת חלבון לתכנון או שינוי חלבונים. טכניקות טיהור חלבון אלה ממטבות את תכונות החלבון ליישומים תעשייתיים ספציפיים.

טכניקות אלה מחייבות מדענים לבודד ולטהר חלבונים בעלי עניין, כך שניתן יהיה ללמוד את הקונפורמציות שלהם וספציפיות המצע. כמו כן, הדורשים בדיקות הן התגובות עם ליגנדים אחרים (חלבון הנקשר לחלבון קולטן) ופעילויות אנזים ספציפיות.

מידת טוהר החלבון הנדרש תלוי בשימוש הסופי המיועד לחלבון. עבור יישומים מסוימים, תמצית גולמית מספיקה. לשימושים אחרים, כמו במזונות ותרופות, דרושה רמת טוהר גבוהה. מספר טכניקות עבור טיהור חלבון משמשים כדי להגיע לרמת טוהר נדרשת.

כל שלב לטיהור חלבונים מביא בדרך כלל לאובדן מסוים של המוצר. לפיכך, אסטרטגיית טיהור חלבון אידיאלית היא כזו בה ניתן להגיע לרמת הטיהור הגבוהה ביותר בשלבים המעטים ביותר.

הבחירה באילו צעדים להשתמש תלויה בגודל, במטען, במסיסות ובמאפיינים אחרים של חלבון המטרה. הטכניקות הבאות מתאימות ביותר לטיהור חלבון ציטוסולי יחיד.

טיהור מתחמי חלבון ציטוזולי הוא מורכב יותר ובדרך כלל דורש ליישם שיטות שונות.

השלב הראשון בטיהור חלבונים תוך תאיים (בתוך התא) הוא הכנת תמצית גולמית. התמצית תכיל תערובת מורכבת של כל החלבונים מהציטופלזמה התאית, וכמה מקרומולקולות נוספות, קופקטורים וחומרים מזינים.

תמצית גולמית זו עשויה לשמש ליישומים מסוימים בביוטכנולוגיה. עם זאת, אם טוהר הנושא, יש לבצע את פעולות הטיהור הבאות. תמציות חלבון גולמי מוכנות על ידי הסרת פסולת תאית הנוצרת על ידי תמוגה של תאים, המושגת באמצעות כימיקלים, אנזימים, sonication או עיתונות צרפתית.

הפסולת מוסרת על ידי צנטריפוגה, ואת supernatant (הנוזל מעל שאריות מוצקה) הוא התאושש. ניתן להשיג תכשירים גולמיים של חלבונים חוץ-תאיים (מחוץ לתא) על ידי פשוט הסרת התאים על ידי צנטריפוגה.

בוודאות ביוטכנולוגיה ביישומים, יש ביקוש לאנזימים תרמוסטטיים - אנזימים שיכולים לסבול טמפרטורות גבוהות ללא דאטורציה, תוך שמירה על פעילות ספציפית גבוהה.

אורגניזמים המייצרים חלבונים עמידים בחום נקראים לעיתים קיצוניים. גישה קלה לטיהור חלבון עמיד בחום היא להפחית את שאר החלבונים בתערובת על ידי חימום ואז קירור הפיתרון (ובכך לאפשר לאנזים התרמוסטטי לבצע רפורמה או להמיס מחדש, אם נחוץ). לאחר מכן ניתן להסיר את החלבונים המופרכים באמצעות צנטריפוגה.

מודרני ביוטק פרוטוקולים מנצלים לרוב את הערכות השיטות הרבות המסחריות הזמינות ומסחריות המספקות פתרונות מוכנים לנהלים רגילים. טיהור חלבונים מתבצע לרוב באמצעות פילטרים ועמודי סינון ג'ל מוכנים.

עקוב אחר הוראות ערכת הדיאליזה והוסף את הנפח הנכון של הפתרון הנכון והמתן ל משך זמן מוגדר בזמן איסוף החומר הגליל (הממס עבר דרך העמודה) בבדיקה טרייה צינור.

ניתן ליישם שיטות כרומטוגרפיות באמצעות עמודות-ספסל או ציוד HPLC אוטומטי. ההפרדה באמצעות HPLC יכולה להיעשות בשיטות הפוך, החלפת יונים או הדרת גודל, ודגימות המתגלות על ידי מערך דיודות או טכנולוגיית לייזר.

בעבר, צעד שני נפוץ לטיהור חלבון מתמצית גולמית היה על ידי משקעים בתמיסה עם חוזק אוסמוטי גבוה (כלומר תמיסות מלח). משקעים של חלבונים נעשים בדרך כלל באמצעות אמוניום סולפט כמלח. ניתן להסיר חומצות גרעין בתמצית הגולמית על ידי משקע אגרגטים הנוצרים עם סטרפטומיצין סולפט או פרוטמין סולפט.

משקעים מלח בדרך כלל לא מובילים לחלבון מטוהר מאוד, אך יכולים לסייע בהעלמת כמה חלבונים לא רצויים בתערובת, ובריכוז הדגימה. לאחר מכן מוסרים מלחים בתמיסה באמצעות דיאליזה דרך צינורות תאית נקבובית, סינון או כרומטוגרפיה של הדרת ג'ל.

חלבונים שונים ישקעו בריכוזים שונים של אמוניום סולפט. באופן כללי, חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה יותר משקעים בריכוזים נמוכים יותר של אמוניום סולפט.

כרומטוגרפיה הפוכה (RPC) מפרידה חלבונים על בסיס ההידרופוביות היחסית שלהם (הרחקה של מולקולות לא קוטביות מהמים). טכניקה זו היא סלקטיבית ביותר אך מחייבת שימוש בממסים אורגניים.

ישנם חלבונים המופרכים דרך קבע על ידי ממסים והם יאבדו את הפונקציונליות במהלך RPC. לכן שיטה זו אינה מומלצת לכל היישומים, במיוחד אם יש צורך בחלבון המטרה לשמור על פעילות.

כרומטוגרפיה של חילופי יונים מתייחסת להפרדת חלבונים על בסיס מטען. ניתן להכין עמודות לחילופי אניונים או להחלפת קטיונים. עמודות חילופי אניונים מכילות שלב נייח עם מטען חיובי שמושך חלבונים טעונים שלילית.

עמודות להחלפת קטיונים הן החרוזים ההפוכים והמטענים השליליים המושכים חלבונים טעונים חיובית. Elution (חילוץ חומר אחד מחומר אחר) של חלבון המטרה (ים) נעשה על ידי שינוי ה- pH פנימה העמודה, שמביאה לשינוי או נטרול של הקבוצות הפונקציונליות הטעונות של כל אחת מהן חלבון.

כרומטוגרפיה של הרחקת גודל (המכונה גם סינון ג'ל) מפרידה בין חלבונים גדולים יותר קטנים יותר אלו מאחר והמולקולות הגדולות נעות מהר יותר דרך הפולימר הצולב בין הכרומטוגרפיה טור. החלבונים הגדולים אינם נכנסים לנקבוביות הפולימר ואילו חלבונים קטנים יותר אכן לוקחים זמן רב יותר דרך עמודת הכרומטוגרפיה, בדרך פחות ישירה.

אלואט (תוצאה של elution) נאסף בסדרה של צינורות המפרידים חלבונים על בסיס זמן elution. סינון ג'ל הוא כלי שימושי לריכוז דגימת חלבון מכיוון שחלבון המטרה נאסף בנפח elution קטן יותר ממה שנוסף בתחילה לטור. ניתן להשתמש בטכניקות סינון דומות במהלך ייצור חלבונים בקנה מידה גדול בגלל יעילותן.

כרומטוגרפיה של זיקה היא טכניקה שימושית מאוד ל"ליטוש ", או להשלמת תהליך טיהור החלבון. חרוזים בעמודה הכרומטוגרפית מקושרים צלב לליגנדים הנקשרים באופן ספציפי לחלבון המטרה.

לאחר מכן מוציאים את החלבון מהעמוד על ידי שטיפה בתמיסה המכילה ליגנדים חופשיים. שיטה זו נותנת את התוצאות הטהורות ביותר ואת הפעילות הספציפית הגבוהה ביותר בהשוואה לטכניקות אחרות.

SDS-PAGE (נתרן דודציל סולפט המשמש באלקטרופורזה ג'ל של polyacrylamide) נקשר לחלבונים המעניקים להם מטען שלילי גדול נטו. מכיוון שהמטענים של כל החלבונים שווים למדי, שיטה זו מפרידה ביניהם כמעט לחלוטין על סמך הגודל.

SDS-PAGE משמש לעיתים קרובות לבדיקת טוהר החלבון לאחר כל שלב בסדרה. ככל שמוסרים בהדרגה את החלבונים הלא רצויים מהתערובת, מספר הלהקות המדומות בג'ל SDS-PAGE מצטמצם, עד שיש רק להקה אחת המייצגת את החלבון הרצוי.

Immunoblotting היא טכניקת הדמיית חלבונים המיושמת בשילוב עם כרומטוגרפיה של זיקה. נוגדנים לחלבון ספציפי משמשים כליגנדים בעמודת כרומטוגרפיה של זיקה.

חלבון המטרה נשמר על העמוד, ואז מוסר על ידי שטיפת העמוד בתמיסת מלח או סוכנים אחרים. נוגדנים המקושרים לתוויות רדיואקטיביות או צבעוניות מסייעים באיתור חלבון המטרה ברגע שהוא מופרד משאר התערובת.