טכניקות לרצף DNA

התחום של ביוטכנולוגיה הוא שינוי תמידי. הצמיחה המהירה והפיתוח של מחקר חדשני תלויים בחדשנות והיצירתיות של מדענים ויכולתם לראות את הפוטנציאל בטכניקה מולקולרית בסיסית ולהחיל אותה על חדש תהליכים. הופעתה של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) פתחו דלתות רבות במחקר גנטי, כולל אמצעי ניתוח DNA וזיהוי גנים שונים על בסיס רצפי ה- DNA שלהם. רצף ה- DNA תלוי גם ביכולת השימוש שלנו ג'ל אלקטרופורזה כדי להפריד בין גדילי DNA השונים בגודלם לפי צמד בסיס אחד.

בסוף שנות השבעים הומצאו שתי טכניקות רצף DNA למולקולות DNA ארוכות יותר: שיטת הסנגר (או הדידוקסי) ושיטת מקסאם-גילברט (מחשוף כימי). שיטת מקסאם-גילברט מבוססת על מחשוף ספציפי לנוקלאוטידים על ידי כימיקלים, והיא משמשת בצורה הטובה ביותר לרצף אוליגונוקליאוטידים (פולימרים נוקליאוטידים קצרים, בדרך כלל קטנים יותר מ- 50 זוגות בסיס באורך). שיטת סנגר נפוצה יותר מכיוון שהיא הוכחה כקל יותר ליישום, וגם עם ה- הופעת ה- PCR ואוטומציה של הטכניקה, מיושמת בקלות על גדילי DNA ארוכים כולל חלקים שלמים גנים. טכניקה זו מבוססת על סיום שרשרת על ידי דידויקסינוקלאוטידים במהלך תגובות התארכות PCR.

בשיטת סנגר, גדיל ה- DNA שיש לנתח משמש כתבנית ומשתמש בפולימראז DNA, בתגובת PCR, ליצירת גדילים משלימים באמצעות פריימרים. מכינים ארבע תערובות תגובה שונות של PCR, שכל אחת מהן מכילה אחוז מסוים של אנלוגים דידויקסינוקלאוזיד טריפוספט (ddNTP) לאחד מארבעת הנוקלאוטידים (ATP, CTP, GTP או TTP).

הסינתזה של גדיל ה- DNA החדש נמשכת עד לשילוב של אחד מאותם אנלוגים, ובזמן זה הקצוץ מקוצץ בטרם עת. כל תגובת PCR בסופו של דבר תכיל תערובת של אורכים שונים של גדילי DNA, והכל מסתיים בגרעין הנוקראוטיד שתויג לתגובה זו. ג'ל אלקטרופורזה לאחר מכן משתמשים בכדי להפריד בין גדילי ארבע התגובות, בארבעה נתיבים נפרדים, ולקביעת רצף התבנית המקורית על סמך אילו אורכי גדילים מסתיימים באיזה נוקליאוטיד.

בתגובת הסנגר האוטומטית משתמשים בפריימרים המסומנים בארבעה תגי ניאון צבעוניים שונים. תגובות PCR, בנוכחות הדידויקסינוקוטיוטיות השונות, מבוצעות כמתואר לעיל. עם זאת, בשלב הבא, ארבע תערובות התגובה משולבות ואז מוחלות על נתיב יחיד של ג'ל. צבע כל שבר מתגלה באמצעות קרן לייזר והמידע נאסף על ידי מחשב המייצרת כרומטוגרמות המציגות שיאים לכל צבע, ממנו יכול להיות רצף ה- DNA של התבנית נחוש בדעתו.

בדרך כלל, שיטת הרצף האוטומטית מדויקת רק עבור רצפים של עד 700-800 זוגות בסיס לכל היותר. עם זאת, ניתן להשיג רצפים מלאים של גנים גדולים יותר, ולמעשה גנום שלם, בשיטות צעד-צעדים כמו פריימר הליכה ורצף רובה ציד.

ב- Primer Walking, חלק מעובד מגן גדול יותר הוא רצף בשיטת סנגר. פריימרים חדשים נוצרים מקטע אמין ברצף ומשמשים להמשך רצף החלק של הגן שהיה מחוץ לטווח התגובות המקוריות.

רצף רובה ציד כרוך בחיתוך אקראי של קטע ה- DNA למתאים יותר שברים בגודל (הניתנים לניהול), רצף כל שבר וסידור החלקים על בסיס חפיפה רצפים. טכניקה זו הופכת לקלה יותר על ידי יישום תוכנת מחשב לסידור החלקים החופפים.