כיצד פועלת תגובת שרשרת פולימראז כדי להגביר גנים

תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) היא טכניקה גנטית מולקולרית להכנת עותקים מרובים של גן והיא גם חלק מתהליך ריצוף הגנים.

עותקי גנים נעשים באמצעות דגימה של DNA, והטכנולוגיה מספיק טובה כדי ליצור עותקים מרובים מעותק אחד בודד של הגן שנמצא בדגימה. הגברת PCR של גן ליצירת מיליוני עותקים, מאפשרת זיהוי וזיהוי של רצפי גנים באמצעות טכניקות חזותיות המבוססות על גודל ומטען (+ או -) של פיסת ה-DNA.

בתנאים מבוקרים, מקטעים קטנים של DNA נוצרים על ידי אנזימים הידועים בשם DNA פולימראזות, שמוסיפים דאוקסינוקלאוטידים משלימים (dNTPs) לפיסת DNA המכונה "תבנית". אפילו חתיכות קטנות יותר של DNA, הנקראות "פריימרים" משמשות כנקודת מוצא ל- פולימראז.

פריימרים הם חלקים קטנים מעשה ידי אדם (אוליגומרים), בדרך כלל באורך של בין 15 ל-30 נוקלאוטידים. הם נוצרים על ידי ידיעה או ניחוש של רצפי DNA קצרים בקצוות של הגן המוגבר. במהלך ה-PCR, ה-DNA המרוצף מחומם והגדילים הכפולים נפרדים. לאחר הקירור, הפריימרים נקשרים לתבנית (הנקראים חישול) ויוצרים מקום לתחילת הפולימראז.

תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) התאפשרה הודות לגילוי של תרמופילים ותרמופילים אנזימי פולימראז (אנזימים השומרים על שלמות מבנית ופונקציונליות לאחר חימום גבוה טמפרטורות). השלבים המעורבים בטכניקת PCR הם כדלקמן:

• נוצרת תערובת, עם ריכוזים אופטימליים של תבנית ה-DNA, אנזים פולימראז, פריימרים ו-dNTPs. היכולת לחמם את תערובת ללא דנטורציה של האנזים מאפשרת דנטורציה של הסליל הכפול של דגימת ה-DNA בטמפרטורות בטווח של 94 מעלות צֶלסִיוּס.
• לאחר הדנטורציה, הדגימה מקוררת לטווח מתון יותר, בסביבות 54 מעלות, מה שמקל על חישול (קישור) של הפריימרים לתבניות ה-DNA החד-גדילי.
• בשלב השלישי של המחזור, הדגימה מחוממת ל-72 מעלות, הטמפרטורה האידיאלית עבור Taq DNA Polymerase, להתארכות. במהלך התארכות, DNA פולימראז משתמש בגדיל ה-DNA הבודד המקורי כתבנית כדי להוסיף dNTPs משלימים לקצוות 3' של כל פריימר וליצור קטע של DNA דו-גדילי באזור הגן המעניין.
• פריימרים שהתחברו לרצפי DNA שאינם התאמה מדויקת אינם נשארים מחולים ב-72 מעלות, ובכך מגבילים את ההתארכות לגן המעניין.

תהליך זה של דנטורציה, חישול והתארכות חוזרים על עצמם מספר רב של (30-40) פעמים, ובכך מגדילים באופן אקספוננציאלי את מספר העותקים של הגן הרצוי בתערובת. למרות שתהליך זה יהיה די מייגע אם יבוצע באופן ידני, ניתן להכין דגימות ולהדגר ב- Thermocycler הניתן לתכנות, נפוץ כיום ברוב המעבדות המולקולריות, וניתן לבצע תגובת PCR מלאה ב 3-4 שעות.

כל שלב דנטורציה עוצר את תהליך ההתארכות של המחזור הקודם, ובכך חותך את הגדיל החדש של ה-DNA ושומר אותו בגודל בערך של הגן הרצוי. משך מחזור ההתארכות יכול להתארך או לקצר בהתאם לגודל הגן המעניין, אך בסופו של דבר, באמצעות מחזורים חוזרים של PCR, רוב התבניות יוגבלו לגודל הגן המעניין בלבד, מכיוון שהן נוצרו ממוצרים של שני פריימרים.

יש כמה שונים גורמים ל-PCR מוצלח שניתן לתמרן כדי לשפר את התוצאות. השיטה הנפוצה ביותר לבדיקת נוכחות של מוצר PCR היא אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. המשמש להפרדה בין שברי DNA על סמך גודל ומטען. לאחר מכן מדמיינים את השברים באמצעות צבעים או רדיואיזוטופים.

מאז גילוי ה-PCR, התגלו פולימראזות DNA שאינן ה-Tak המקורי. לחלקם יש יכולת "הגהה" טובה יותר או שהם יציבים יותר בטמפרטורות גבוהות יותר, ובכך משפרים את הספציפיות של PCR ומפחיתים שגיאות מהכנסת ה-dNTP השגוי.

כמה וריאציות של PCR תוכננו עבור יישומים ספציפיים וכיום נעשה בהן שימוש קבוע במעבדות גנטיות מולקולריות. חלקם הם PCR בזמן אמת ו-Reverse-Transcriptase PCR. הגילוי של PCR הוביל גם לפיתוח של רצף DNA, טביעת אצבע של DNA וטכניקות מולקולריות אחרות.