נוהל כתם גראם במיקרוביולוגיה

כתם גראם הוא שיטת מכתים דיפרנציאלית המשמשת להקצאה חיידקים לאחת משתי קבוצות (גרם-חיובי וגרם-שלילי) על סמך המאפיינים של קירות התא שלהם. זה ידוע גם ככתמי גרם או שיטת גראם. הנוהל נקרא על ידי מי שפיתח את הטכניקה, הבקטריולוג הדני הנס כריסטיאן גראם.

ההליך מבוסס על התגובה בין פפטידוגליקן בדפנות התא של כמה חיידקים. כתם הגראם כולל מכתים של חיידקים, תיקון הצבע במורדנט, גוון צבע של התאים והפעלת דלפק.

1. הכתם העיקרי (סגול קריסטל) נקשר לפפטידוגליקאן, תאי צבע בצבע סגול. בשני התאים חיוביים לגרם וגם בשלילי גרם יש פפטידוגליקני בדפנות התאים שלהם, ולכן בהתחלה, כל החיידקים מכתימים סגול.
2. יוד של גראם (יוד ויודיד אשלגן) מוחל כמורדנט או כמקבע. תאים חיוביים לגרם יוצרים תרכובת יוד סגול קריסטל.
3. אלכוהול או אצטון משמש לריסון התאים. לחיידקים שליליים גראם יש הרבה פחות פפטידוגליקני בדפנות התא שלהם, ולכן שלב זה הופך אותם ללא צבע, בעוד שרק חלק מהצבע מוסר מתאים חיוביים לגרם, שיש בהם יותר פפטידוגליקן (60-90% מקיר התא). דופן התא העבה של תאים חיוביים לגרם מתייבשת על ידי הצעד הסיסור, וגורמת להם להתכווץ ולכידת מתחם הכתמים יוד.
instagram viewer
4. לאחר השלב הסיסמא מוחל משטח נגד (בדרך כלל ספרנין, אך לפעמים פוקסין) כדי לצבוע את החיידק בוורוד. גם חיידקים גרם-חיוביים וגם גריל-שליליים מרימים את הכתם הוורוד, אך הוא אינו נראה מעל הסגול הכהה יותר של החיידק-חיובי. אם הליך ההכתמה מתבצע כראוי, חיידקים חיוביים לגרם יהיו סגולים ואילו חיידקים שליליים גרם יהיו ורודים.

תוצאות הכתם גראם נצפות באמצעות מיקרוסקופיית אור. מכיוון שהחיידקים צבעוניים, לא רק שמזהים את קבוצת כתמי הגראם שלהם, אלא צורתםניתן להבחין בתבנית, בגודל ובגיבוש. זה הופך את כתם הגראם לכלי אבחון חשובים למרפאה או מעבדה רפואית. אמנם ייתכן שהכתם לא בהכרח מזהה חיידקים, אך לעתים קרובות מספיק לדעת אם הם חיוביים לגרם או שלילית לגרם כדי לרשום אנטיביוטיקה יעילה.

ישנם חיידקים עשויים להיות משתנים גרם או בלתי מוגדרים גרם. עם זאת, אפילו מידע זה עשוי להועיל בצמצום הזהות החיידקית. הטכניקה אמינה ביותר כאשר תרבויות בנות פחות מ -24 שעות. אמנם ניתן להשתמש בו בתרבויות מרק, אך עדיף לרכז אותם קודם. המגבלה העיקרית של הטכניקה היא שהיא מניבה תוצאות שגויות אם נעשות טעויות בטכניקה. דרושים תרגול ומיומנות בכדי לייצר תוצאה אמינה. כמו כן, גורם זיהומי לא יכול להיות חיידקי. פתוגנים אוקריוטים מכתימים שלילי גרם. עם זאת, רוב תאים איקריוטיים למעט פטריות (כולל שמרים) לא מצליחים להיצמד לשקופית במהלך התהליך.

• סגול קריסטל (כתם ראשוני)
• יוד של גראם (מורדנט, לתיקון סגול גביש בדופן התא)
• אתנול או אצטון (גוון גוון)
• ספרנין (כתם משני או משטח צבעוני)
• מים בבקבוק להשפריץ או בקבוק טפטפת
• שקופיות מיקרוסקופ
• מיקרוסקופ מתחם

1. הניחו טיפה קטנה של דגימה חיידקית על שקופית. מחממים את החיידקים לשקופית על ידי העברתם דרך להבתו של מבער בונסן שלוש פעמים. הפעלת חום רב מדי או יותר מדי זמן עלולה להמיס את דפנות התא של החיידק, ולעוות את צורתן ולהוביל לתוצאה לא מדויקת. אם מופעל מעט מדי חום, החיידקים ישטפו את השקופית במהלך הכתמה.
2. השתמש בטפטפת כדי להחיל את הכתם הראשוני (סגול גביש) על השקופית ולאפשר לו לשבת במשך דקה. שוטפים בעדינות את השקופית במים לא יותר מחמש שניות בכדי להסיר עודף כתם. שטיפה ארוכה מדי עלולה להסיר צבע רב מדי, בעוד שלא שטיפה מספיק זמן עשויה לאפשר לכתם רב מדי להישאר על תאים שליליים גרם.
3. השתמש בטפטפת כדי להחיל את יוד של גראם על השקופית כדי לתקן את סגול הקריסטל לדופן התא. תן לזה לשבת דקה.
4. יש לשטוף את השקופית באלכוהול או באצטון כשלוש שניות, לאחר מכן מיד עם שטיפה עדינה במים. התאים השליליים לגרם יאבדו צבע ואילו התאים החיוביים לגרם יישארו סגולים או כחולים. עם זאת, אם המירק יושאר ארוך מדי, כל התאים יאבדו צבע!
5. החל את הכתם המשני, ספרנין, ואפשר לו לשבת במשך דקה. יש לשטוף בעדינות במים לא יותר מחמש שניות. על התאים השליליים לגרם להיות מוכתם בצבע אדום או ורוד, ואילו התאים החיוביים לגרם עדיין יופיעו בצבע סגול או כחול.
6. צפו בשקופית באמצעות מיקרוסקופ מורכב. יתכן שיהיה צורך בהגדלה של 500 עד 1000X כדי להבחין בין צורת התאים וסידורם.

לא כל החיידקים המזוהים על ידי כתם הגראם קשורים למחלות, אך מספר דוגמאות חשובות כוללות:

• קוקי חיובי גרם (עגול):Staphylococcus aureus
• קוקי גרם שלילי:Neisseria meningitidis
• בייקילי חיובי עם גרם (מוטות): Bacillus anthracis
• בילילי גרם-שלילי:אי קולי