הכל על אנזימים להגבלה

Endonucleases הגבלה הם סוג של אנזים שחתכו מולקולות DNA. כל אנזים מזהה רצפים ייחודיים של נוקלאוטידים בגדול DNA - בדרך כלל כארבעה עד שישה זוגות בסיס. הרצפים הם palindromic בכך שחוט DNA משלים יש אותו רצף בכיוון ההפוך. במילים אחרות, שני גדילי ה- DNA נחתכים באותו מקום.

אנזימי הגבלה נמצאים בזנים רבים ושונים של חיידקים בהם תפקידם הביולוגי הוא להשתתף בהגנה על התא. אנזימים אלה מגבילים DNA זר (נגיפי) שנכנס לתאים על ידי השמדתם. לתאים המארחים יש מערכת שינוי הגבלה המתתת את ה- DNA שלהם באתרים ספציפיים לאנזימי ההגבלה שלהם בהתאמה, ובכך להגן עליהם מפני המחשוף. יותר מ- 800 אנזימים ידועים התגלו שמזהים יותר ממאה רצפי נוקלאוטידים שונים.

ישנם חמישה סוגים שונים של אנזימי הגבלה. סוג I חותך DNA במקומות אקראיים עד 1,000 זוגות בסיס או יותר מאתר ההכרה. חתכים מסוג III בכ- 25 זוגות בסיס מהאתר. שני סוגים אלה דורשים ATP ויכולים להיות אנזימים גדולים עם מספר יחידות משנה. אנזימים מסוג II המשמשים בעיקר בביוטכנולוגיה, חותכים DNA ברצף המוכר ללא צורך ב- ATP והם קטנים ופשוטים יותר.

אנזימי הגבלה מסוג II נקראים על פי מינים חיידקיים מהם הם מבודדים. לדוגמה, האנזים EcoRI היה מבודד מ- E. קולי. רוב הציבור מכיר את א. התפרצויות קולי באוכל.

אנזימי הגבלה מסוג II יכולים ליצור שני סוגים שונים של חתכים, תלוי אם הם חותכים את שניהם גדילים במרכז רצף הזיהוי או כל גדיל קרוב יותר לקצה אחד של ההכרה סדר פעולות.

הגזירה לשעבר תייצר "קצוות בוטים" ללא כל תליית נוקליאוטידים. זה האחרון מייצר קצות "דביקים" או "מלוכדים" מכיוון שלכל שבר של די-אן-איי שנוצר יש תליית יתר המשלימה לשברים האחרים. שניהם מועילים בגנטיקה מולקולרית לייצור DNA רקומביננטי וחלבונים. צורה של DNA זו בולטת מכיוון שהיא מיוצרת על ידי קשירה (קשירה זו לזו) של שני גדילים שונים או יותר שלא במקור נקשרו זה לזה.

אנזימים מסוג IV מכירים ב- DNA מתילתי, ואנזימים מסוג V משתמשים ב- RNA כדי לחתוך רצפים על אורגניזמים פולשים שאינם פלינדרומיים.

אנזימי הגבלה משמשים בביוטכנולוגיה כדי לחתוך את ה- DNA לחלקים קטנים יותר על מנת ללמוד הבדלי אורך שברים בקרב פרטים. זה מכונה polymorphism אורך שבר הגבלה (RFLP). הם משמשים גם לשיבוט גנים.

טכניקות RFLP שימשו כדי לקבוע כי לאנשים או קבוצות של יחידים יש הבדלים מובחנים ברצפי הגנים ודפוסי המחשוף של הגבלה באזורים מסוימים בגנום. הכרת התחומים הייחודיים הללו היא הבסיס טביעת אצבעות DNA. כל אחת מהשיטות הללו תלויה בשימוש ב- אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז להפרדת שברי ה- DNA. חיץ TBE, המורכב מבסיס טריס, חומצה בורית ו- EDTA, משמש לרוב לג'ל אגרוז אלקטרופורזה לבחון מוצרי DNA.

שיבוט מחייב לרוב הכנסת גן לפלסמיד, שהוא סוג של פיסת DNA. אנזימי הגבלה יכולים לסייע בתהליך בגלל התלויים החד-חוטים שהם משאירים כאשר הם מבצעים חתכים. DNA ligase, אנזים נפרד, יכול לחבר בין שתי מולקולות DNA עם קצוות תואמים.

אז, על ידי שימוש באנזימי הגבלה עם אנזימי DNA ליגאז, ניתן להשתמש בחתיכות DNA ממקורות שונים ליצירת מולקולת DNA יחידה.